Trong bài này sẽ hướng dẫn chi tiết cách sử dụng một phần mềm
thiết kế mồi phổ biến và miễn phí là Primer-Blast để thiết kế cặp mồi mong muốn.
Hơn nữa, bài viết còn giới thiệu và đưa ra sự so sánh giữa một số phần mềm thiết
kế mồi khác nhau.
1. Hướng dẫn sử dụng phần mềm thiết kế mồi
Primer – Blast
Primer-BLAST là một công cụ được phát triển bởi NCBI giúp
người dùng thiết kế mồi đặc hiệu cho một phản ứng PCR cụ thể. Primer-BLAST sử dụng mã nguồn mở Primer3 để thiết kế mồi, sau đó dùng công cụ
BLAST và thuật toán định tuyến tổng quát (global
alignment) để kiểm tra trong cơ sở dữ liệu của NCBI nhằm tránh các sai sót kết
cặp, tương đồng chéo là nguyên nhân dẫn đến phản ứng PCR không hiệu quả.
Quá trình thiết kế đoạn mồi sử dụng Primer-BLAST thường diễn ra theo 2 bước:
- Thu thập khuôn mẫu
- Thiết kế đoạn mồi
1.1. Thu thập khuôn mẫu
Một ưu điểm khá lớn khi sử dụng Primer-BLAST là người dùng có thể tận dụng tối đa nguồn cơ sở dữ liệu từ NCBI.
Ví dụ sau đây chúng tôi sẽ hướng dẫn thiết kế mồi cho đoạn gen
YP_009173871.1 quy định cấu trúc vỏ nhỏ protein của virus viêm gan siêu vi B.
Bước 1: Truy cập cơ sở dữ liệu của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
chọn “Nucleotide database” và tìm kiếm sử dụng từ khóa “Hepatitis B virus genome”.
Bước 2: Kết quả trả về là hàng loạt các dữ liệu bộ gen
khác nhau của virus viêm gan siêu vi B. Chúng ta sẽ chọn kết quả đầu tiên. Ở
phần kết quả số 1 này, sẽ có 3 định dạng là: GenBank, FASTA và Graphics. Để thu
chuỗi khuôn mẫu chúng ta có thể chọn FASTA hoặc Graphics nhưng chúng tôi có lời
khuyên nên sử dụng Graphics của NCBI thì sẽ hiệu quả hơn rất nhiều. Vì vậy ở
mục này chúng ta sẽ chọn Graphics để đánh giá trực quan toàn bộ bộ gen của
virus (xem hình 1).
Bước 3: Bộ gen của virus được biểu diễn dưới dạng hình
ảnh trực quan (Hình 2). Toàn bộ các gen đều được chú thích và khi click vào
từng gen sẽ hiện ra thông tin chi tiết về gen đó.
Trong ví dụ này, chúng ta
sẽ chọn gen YP_009173871.1 quy định cấu trúc vỏ nhỏ protein.
Bước 4: Bảng nhỏ hiện lên sau khi chúng ta chọn gen có
chứa dòng “FASTA View” . Click vào vào mục 1 bắt đầu bằng ký hiệu NC_ sẽ hiện
ra chuỗi của gene này dưới dạng file FASTA (hình). Vậy bước đầu thu thập khuôn
mẫu đã hoàn thành trên cơ sở dữ liệu NCBI
Lưu ý: Như ở phần Graphics trên còn cung cấp cho chúng ta những
đoạn gen theo chiều ngược lại (Gen mang màu đen). Vì vậy trước khi thực hiện
thiết kế mồi, chúng ta cần phải đảo ngược đoạn khuôn mẫu này lại cho đúng chiều
5’-3’.
1.2. Thiết kế đoạn mồi
(1) Khung nhập dữ liệu chuỗi khuôn mẫu: Nhập chuỗi dưới dạng
file FASTA
(2) Thông số về nhiệt độ nóng chảy (Tm )của đoạn mồi : điều chỉnh giống với thông số của nguyên tắc thiết
kế mồi ở phần 1 của loạt bài viết về thiết kế mồi cho phản ứng PCR
Ngoài ra còn rất nhiều các
thông số nâng cao khác nhưng ở bài này chúng ta sẽ chỉ đi về mặt cơ bản. Vì thế
hầu hết các thông số sẽ ở dạng mặc định.
Bước 2: Đánh giấu bỏ dòng “Enable search for primer
pairs specific to the intended PCR template” để bỏ qua việc tìm kiếm cặp mồi có
sẵn trong cơ sở dữ liệu của NCBI. Sau đó chúng ta thu về thiết kế primer bằng
cách ấn vào ô “Get Primers”.
Cuối cùng, kết quả đoạn mồi thu được sẽ ở 2 dạng: hình ảnh trực
quan và thông tin chi tiết về kết quả.
2. Đánh giá các phần mềm phổ biến hiện nay
- Phần mềm FastPCR là công
cụ tích hợp hàng loạt các tính năng toàn diện và chuyên nghiệp dùng để thiết
kế mọi loại mồi cho PCR. Mặc dù vậy, điểm yếu của phần mềm này là sự quá
phức tạp khi sử dụng.
- Primer-BLAST là một phần mềm online được cung cấp bởi The National Center
for Biotechnology Information (NCBI). Phần
mềm này được tạo nên nhờ sự kết hợp giữa Primer3 và BLAST. Nổi trội nhờ khả năng sử dụng cơ sở dữ liệu lớn của NCBI
bằng BLAST nhưng là một công cụ
online, Primer-BLAST không tránh khỏi những hạn
chế.
- Primer3 là một phần mềm mã
nguồn mở cực kỳ nổi tiếng và BatchPrimer3 là bản phát triển sau này. Đặc
điểm nổi bật của BatchPrimer là việc chạy trên nền web online và khả năng
chạy thông lượng lớn đầu vào giúp BatchPrimer3 là một trong những công cụ
phổ biến trong thiết kế mồi cho PCR nhằm thay thế cho người anh Primer3.
| Đặc điểm | jPCR Tool &FastPCR | NCBI/Primer-BLAST (Primer3) | BatchPrimer3 (Primer3) | IDT SciTools: PrimerQuest, OligoAnalyzer 3.1 | PerlPrimer |
| Độ dài Primer (nt) | 12-500 | 15-30 | Chưa rõ | 16-35 | 12-30 |
| Giới hạn độ dài khuôn mẫu (nt) | Không giới hạn | 50,000 | Chưa rõ | Không giới hạn | Không giới hạn |
| Tốc độ tính toán | rất nhanh | chậm | chậm | chậm | chậm |
| Cho phép chạy thông lượng lớn với hàng loạt khuôn mẫu và hàng loạt mục tiêu trên khuôn cùng lúc | có | không | có | không | không |
| Tùy chọn PCR cho khuôn mẫu | có | có | có | có | có |
| Degenerated nucleotides at all operation (Tm calculation, searches and probe, primer design etc.) | có | không | có | có | không |
| Cho phép sửa đổi LNA (Nucleotide đã khóa) hoặc các nucleotide khác | có | không | không | có | không |
| Tính toán nhằm tối ưu hóa nhiệt độ anneal sử dụng | có | không | không | không | không |
| Kiểm tra đầu 3’ kết thúc của mồi giao và tự tạo dimer | có | Lỗi | có | có | có |
| Kiểm tra mồi nội giao và tự tạo dimer | có | Lỗi | không | Lỗi | có |
| Tìm kiếm khuôn mẫu sử dụng BLAST | không | có | không | không | có |
| Kiếm tra khuôn mẫu | có | có | không | không | không |
| Kiểm tra khuôn mẫu dựa trên thư viện sẵn có | có | có | không | không | có |
Bảng 1:So sánh các công cụ thiết kế Primer và phân tích oligonucleotide phổ biến hiện nay
Ghi chú: Bảng so sánh trên mang tính chất tương đối vì do công ty cung cấp phần mềm jPCR Tool &FastPCR thống kê, vì thế khả năng các đặc điểm mang tính chất có lợi hơn so với các công cụ khác. Mặc dù vậy, đây là tài liệu đáng để tham khảo.
Tổng hợp: Phạm Trường Duy
Biên Tập: Vũ Đình Chất
Tham khảo:
- PrimerDigital.
Nguồn: ibsgacademic.com
