Nguyên lý thiết kế mồi cho phản ứng PCR

HieuBio

PCR là một trong những phát minh quan trọng nhất của thế kỉ 20. Phản ứng này nhằm sao chép tạo ra một lượng lớn phân tử ADN đích, giúp xác định, và phát hiện các mầm bệnh lây nhiễm như HIV, viêm gan hoặc phát hiện các thay đổi về mặt di truyền như đột biến. PCR được thực hiện thông qua 3 bước: biến tính (denaturing), gắn mồi (annealing), và kéo dài chuỗi (extending). ADN được sử dụng làm khuôn có cấu trúc xoắn kép, khi bị biến tính bởi nhiệt nó tách ra thành 2 mạch đơn, một mạch mang nghĩa (sense) và một mạch đối nghĩa (antisense). Khi nhiệt độ hạ xuống đến nhiệt độ gắn mồi, một mồi sẽ gắn đặc hiệu vào mạch mang nghĩa trong khi một mồi khác sẽ gắn vào mạch đối nghĩa. Trong đó, mồi là các trình tự oligonucleotide ngắn có thể bám đặc hiệu vào một vùng trình tự nhất định. Mồi sẽ là điểm khởi đầu để các polymerase có thể thực hiển tổng hợp mạch bổ sung mới cũng như xác định đoạn ADN được khuếch đại. Do đó, việc thiết kế mồi sẽ quyết định mức độ đặc hiệu và năng suất của phản ứng.

Nguồn Ảnh: httpwww.yourgenome.orgfactswhat-is-pcr-polymerase-chain-reaction

Nguyên tắc thiết kế mồi

1. Độ dài của mồi: Nên nằm trong khoảng từ 15-30 base, độ dài tối ưu là khoảng từ 18-22 base. Điều này phụ thuộc vào việc mồi cần đủ dài để gắn đặc hiệu và đủ ngắn để có thể gắn dễ dàng vào khuôn tại nhiệt độ gắn mồi.

2. Đầu 3’ và 5’ của mồi: Cần thiết kế sao cho đầu 3’ của mồi xuôi sẽ mở rộng về phía mồi ngược và đầu 3’ của mồi ngược sẽ mở rộng về phía mồi xuôi khi được gắn vào 2 mạch bổ sung. Nếu ngược lại thì sản phẩm PCR sẽ không thể được tạo ra.

Nguồn Ảnh: Antisense Science

3. Nhiệt độ nóng chảy của mồi Tm: Điểm nhiệt độ này được định nghĩa là điểm nhiệt mà tại đó 50% sợi đôi ADN phân tách nhau và tạo sợi đơn. Điểm nhiệt này rất quan trọng ở pha gắn mồi, Tm nên nằm trong khoảng 50-65^oC. Nhiệt độ nóng của mồi trên 65 độ dễ dẫn đến xu hướng mồi gắn không chính xác. Nhiệt độ Tm của hai mồi không chênh lệch nhau quá 2^oC, nhiệt độ chênh lệch quá 5^oC có thể không thể tạo ra được sản phẩm. Công thức tính Tm như sau:

• Công thức đơn giản: Tm=4°C x (G + C) + 2°C x (A + T)
• Công thức chứa nồng độ muối: Tm = 81.5 +16.6 x (log10[Na+]) + 0.41 x (%(G+C)) – 675/n

Trong đó: [Na+] là nồng độ phân tử muối, n là số base của mồi.

4. Nhiệt độ gắn mồi (Ta): Được tính dựa vào nhiệt động nóng chảy của mồi. Nhiệt độ gắn mồi thấp có thể dẫn đến lượng sản phẩm PCR được tạo ra thấp, do không đủ số lượng phức hợp lai giữa mồi và khuôn. Ngược lại, sản phẩm không đặc hiệu sẽ được tạo ra nhiều nếu nhiệt độ gắn mồi quá thấp. Người ta thường tính nhiệt độ gắn mồi theo công thức sau:

Ta = 0.3 x Tm(Mồi) + 0.7 Tm (sản phẩm) – 14.9

5. Mật độ GC: Ảnh hưởng đến Tm, do đó mật độ GC nên nằm trong khoảng 50 - 60%.

6. Kẹp GC: Nên có ít nhất một G hoặc C ở đầu 3’ của mồi để giúp cho đầu 3’ của mồi liên kết mạnh hơn. Tuy nhiên nên tránh việc trong 5 base đầu 3’ có nhiều hơn 3 G hoặc C do có thể gây liên kết đầu 3’ quá mạnh khiến mồi bắt cặp không đặc hiệu.

7. Lưu ý cấu trúc bậc 2 trong thiết kế mồi

a) Hình thành hiện tượng kết cặp (dimer): Là hiên tương mồi thay vì gắn vào khuôn sẽ gắn vào mồi ngược với nó hoặc với chính nó, tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước nhỏ và làm giảm lượng mồi bắt cặp với khuôn. Do đó cần tránh tạo ra hiện tượng kết cặp

Hình thành dimer giữa hai mồi

Nguồn ảnh: PREMIER Biosoft

b) Cấu trúc kẹp tóc: có thể được hình thành bởi sự tương tác bên trong chính đoạn mồi. Cần tránh điều này vì làm giảm hiệu quả của phản ứng PCR.

8. Lặp: là hiện tượng lặp lại nhiều lần trong trình tự mồi của trình tự đôi (VD: ATATATATAT) hoặc đơn (VD: GGGGG). Điều này có thể gây bắt cặp nhầm do đó số lần lặp tối đa của một mồi là 4 lần lặp cho cả hai trường hợp.

9. Tương đồng chéo: Là hiện tượng mà cặp mồi sẽ khuếch đại một gene khác có trong hỗn hợp ban đầu. Để tránh hiện tượng này, mồi sau khi thiết kế cần được đưa lên BLAST để so sánh và kiểm tra độ đặc hiệu.

Tổng hợp: Nguyễn Đức Hiếu

Biên Tập: Vũ Đình Chất

Tham khảo:

1. PCR Primer Design Guidelines. PREMIER Biosoft.